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BCG及IL-2激活膀胱癌患者PBMC
及TIL细胞的抗癌活性比较
黄 啸 陈一戎 王家吉 刘国栋
摘要 用Whiteside's法从15例膀胱移行细胞癌患者外周血及癌手术标本中获得的外周血单个核细胞(PBMC)及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，分别用活BCG、死BCG及IL-2刺激培养，计算细胞增殖倍数并测定其抗癌活性。结果，死BCG对细胞并无激活作用；IL-2对细胞的诱导增殖作用强于活BCG，而其激活这两种细胞的抗癌活性低于活BCG激活的抗癌活性。BCG对免疫受抑制的PBMC及TIL细胞的激活作用可能是BCG抗肿瘤重要作用机理之一。并为BCG的进一步临床免疫治疗奠定理论基础。
关键词 膀胱肿瘤；癌；BCG；白介素2；肿瘤浸润淋巴细胞腔内灌注卡介苗(BCG)已被视为治疗膀胱浅表癌的最有效方法之一，但其抗肿癌作用机理仍处于探讨中，目前认为主要与BCG的免疫调理作用有关。膀胱肿瘤患者的免疫状态普遍低下，其免疫细胞均处于免疫抑制状态。Bohle等［1］研究发现，BCG体外可直接激活PBMC成为对肿瘤有明显杀伤力的BCG激活杀伤(BAK)细胞。我们探讨了BCG对免疫抑制的PBMC和TIL细胞的直接激活作用，并把其诱导细胞产生的抗癌活性与IL-2诱导的抗癌活性进行了比较。
1 材料与方法
1.1 临床资料
15例膀胱移行细胞癌患者均经病理诊断所证实。其中男性12例，女性3例；年龄范围从45～76岁，平均60.5岁。病理分级：Ⅰ级5例，Ⅱ级8例，Ⅲ级2例；临床分期：T17例，T26例，T32例；原发10例，复发5例。所有患者在本研究前未接受任何抗癌免疫治疗。
1.2 PBMC的制备
抽取患者手术前一天抗凝静脉血5ml，经聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液常规离心分离获得。
1.3 TIL的制备
基本参照Whiteside's等的方法［2］。
1.4 细胞培养
PBMC及TIL分别置于37°C、5%CO2含活BCG(Pasteur菌株，兰州生物制品研究所)为3.7×104cfu/ml,或含IL-2(军事医学科学院)1000u/ml的全培养基
(含15%小牛血清和2m mol/L L-谷氨酰胺及1m
mol/L丙酮酸钠)中培养14天或25天。死BCG(上述浓度活BCG经100°C，20分钟灭活即得)也在上述条件用来刺激培养这两种细胞。新鲜分离的PBMC及TIL的抗瘤活性被作为对照组。
1.5 靶细胞
Whitesid's法分离的自体肿瘤细胞和人膀胱癌细胞系BIU-87被作为靶细胞。癌细胞经复苏培养，于指数增生期收获用作细胞毒试验。
1.6 细胞毒试验
采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法［3］，效靶比例为50∶1，每项指标均作三孔平行测定取均值。其中(1)自然释放液：0.1ml培养液+0.1ml靶细胞；(2)最大释放液：0.1ml
10% NP40+0.1 ml靶细胞，各测定光密度(OD)值根据以下公式计算杀伤率(%)：
所有数据用±s表示，采用两样本均数比较的t检验作统计处理分析。
2 结果
2.1 细胞增殖
经IL-2刺激培养的PBMC(即LAK)细胞，于培养第3天达其增殖高峰，经活BCG刺激培养的PBMC于培养第7天达其增殖高峰，细胞数分别增殖了18.4倍和11.3倍。而死BCG刺激培养的PBMC细胞增殖明显较前两者缓慢。
与活BCG或IL-2共同培养的TIL培养初期增殖较缓慢，7天后增殖较快，残存的肿瘤细胞逐渐消失，于第14天达增殖高峰，此后逐渐下降，细胞数分别增殖了42.8倍和66.2倍。与死BCG共同培养的TIL细胞增殖明显较前两者缓慢。
2.2 抗癌活性比较
新鲜分离的PBMC及TIL其抗癌活性明显低下(7.4%和11.7%)，经IL-2或活BCG刺激培养后，抗癌活性明显增强，且活BCG在此方面的作用较IL-2强。PBMC细胞抗自体及异体癌活性无显著性差异，而TIL细胞则有显著性差异(附表)。细胞的抗癌活性与细胞增殖峰呈正相关。
附表 不同刺激物培养的效应细胞抗癌活性比较
效应细胞培养方法%抗癌活性(x±s)
自体癌细胞BIU-87
PBMCIL-2(对照)25.4±5.523.8±8.7
活BCG36.2±7.4*31.2±5.4*
死BCG8.2±1.4
TILIL-2(对照)31.5±6.419.6±3.6
活BCG48.3±5.5*30.3±8.3*
死BCG13.8±4.2
* 与对照组相比P<0.05。
3 讨论
BCG灌注在治疗和预防膀胱浅表癌方面的良好效果已被公认，其抗癌机理目前多认为与BCG对免疫系统的作用有关，因膀胱癌患者免疫力普遍低下。TIL已被证实能更准确地反映膀胱肿瘤的局部免疫状态，膀胱壁中TIL浸润的数量及其免疫活性与膀胱肿瘤患者的预后直接相关［4］。我们研究了BCG体外对PBMC及TIL的激活作用，以探讨BCG抗肿瘤的可能作用机理。
实验观察到，活BCG可诱导PBMC及TIL明显增殖，不过其作用低于IL-2。许多临床研究也证明，BCG膀胱灌注后，膀胱壁及粘膜层免疫细胞的数量和构成均发生明显变化，如Boccafoschi等［5］证明，膀胱肿瘤患者在灌注前，抑制性T细胞(Ts)占多数；灌注后，细胞浸润数目明显增加，辅助性T细胞(Tn)对Ts的比值为2∶1。另外，尿中有细胞因子IL-1、IL-2及TNF的释放［5］。
Bohle等证明［1］，活BCG可激活PBMC为卡介苗激活杀伤细胞，即BAK细胞，该细胞可对膀胱癌细胞产生明显的细胞毒性，并在BAK细胞的培养基中检测出IL-1、IL-2、TNF等细胞因子，细胞因子及BCG本身被证实对肿瘤细胞并无细胞毒性［1］。我们的实验结果显示，BAK细胞有不同于LAK细胞的增殖特征，且BAK细胞抗自体瘤活性强于LAK细胞(附表)，具体作用机理尚不清。而Menachem等［6］研究推测，BCG可激活CD4细胞产生IL-2，IL-2可刺激LAK细胞的产生，而LAK细胞被证明能诱导膀胱肿瘤细胞的凋亡，他认为这是BCG抗肿瘤的可能作用机制。Bohle等也认为BAK细胞中可能有LAK细胞的某些亚群［1］。
未经刺激培养的PBMC及TIL抗肿瘤活性很低，与文献报道相符。经活BCG激活后，这两种细胞的抗肿瘤活性明显增强，且活BCG的激活作用强于IL-2(附表)，这与Pryor等的报道相符［7］，Pryor等证实，在增强PBMC和淋巴细胞的抗肿瘤活性方面，BCG优于IL-2和IFN-r，且BCG与这两种细胞因子并无协同作用。Youichi等［8］证实，BCG通过激活效应细胞及增强肿瘤细胞对效应细胞的敏感性两方面来发挥其抗肿瘤作用，实验发现，经BCG培养两小时后的膀胱癌及肾癌细胞，更容易被PBMC或LAK细胞杀伤。Prescott等证明，BCG膀胱灌注可使膀胱癌细胞的HLA-DR抗原表达增强［9］。也有研究表明，BCG的抗肿瘤作用还与BCG保护纤维连接蛋白(FN)有关，因BCG可特异性地与FN结合而保护FN不被肿瘤组织蛋白酶消化破坏，从而使宿主免疫细胞能通过“效应细胞-FN-靶细胞”的结合模式来发挥更强的抗肿瘤作用［10］。实验中，PBMC及TIL与死BCG共同培养后，细胞增殖数量及抗癌活性明显较活BCG低下，可能与BCG灭活后失去了某些生物学特征有关，这对临床强调用活BCG具有重要指导意义。
我们认为，BCG抗肿瘤作用与其活力有关，它对免疫抑制的PBMC及TIL的激活作用优于IL-2，该激活作用可能是BCG抗肿瘤重要作用机理。对BCG抗肿瘤机理的研究也有助于临床制定最佳给药方案和途径，选择适合病例，降低副作用，从而使BCG发挥最大的抗肿瘤效应。
作者单位：730030 兰州，兰州医学院第二附属医院泌尿外科
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